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氨基酸自动分析仪详解

发布时间:17-03-24 11:30分类:技术文章
标签:氨基酸自动分析仪,氨基酸分析仪,氨基酸自动分析仪详解
氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的自动化分析系统,也被称为氨基酸检测仪的仪器,是采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法,对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。此氨基酸分析仪被广泛用于制药、食品、饲料、农业、育种、医学研究、临床诊断和地质考察等领域。指标信息:
分辨率:THR-Ser Ile-leu ≥98% 保留时间重现性:RSD≤0.5% (水解,所有峰)
峰面积重现性:RSD≤1%
(水解,所有峰)。1.原理测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同,在阳离子交换柱上将它们分离,采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来,再逐个以另*路的茚酮试剂混合,然后共同流至螺旋反应管中,于一定温度下(通常为115~120℃)进行显色反应,形成在570nm有*大吸收的蓝紫色产物。其中的羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物,其*大吸收在440nm。这些有色产物对570nm、440nm光的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸的浓度(或含量)之间的关系符合比耳定律,可与标准氨基酸比较作定性和定量测定。2.操作方法①
样品处理:测定样品中各种游离氨基酸含量,可以除去脂肪杂质后,直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解,使蛋白质完全变成氨基酸后才上柱进行分析。②样品分析:经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol
左右(水解样品干重为0.3mg
左右)。测定必须在pH5~5.5、100℃下进行,反应进行时间为10~15min,生成的紫色物质在570nm
波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm
波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析一般只需1h
左右,同时可将几十个样品一起装入仪器,自动按序分析,*后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1~3%,用阳离子交换柱分离及测定氨基酸。3.结果计算带有数据处理机的仪器,各种氨基酸的定量结果能自动打印出来,否则,可用尺子测量。峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外,根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。4.说明①近年出现的采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪,可使蛋白质水解出的17
种氨基酸在12min
内完成分离,且具有灵敏度高(*小检出量可达1pmol)、重现性好以及一机多用等优点。②显色反应用的茚三酮试剂,随着时间推移发色率会降低,故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。5.应用举例(一)医学上的应用氨基酸代谢异常角度阐述了氨基酸与肝性脑病的关系肿瘤组织氨基酸代谢的变化规律必需氨基酸在创伤愈合中的关系血清中11种游离氨基酸的降低可直接影响人体组织的正常发育、生长(二)饲料上的应用质量控制各种饲料必需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当,测定原料和产品中的氨基酸含量,以达到保证质量的目的。真伪鉴别鱼粉氨基酸组成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高,氨基酸分析结果很容易*可以辨别真伪。(三)农业、食品、饮料及其它对酱油级别的认定检验测定茶氨酸来鉴别真伪茶叶对果汁、饮料进行真伪的鉴别对玉米、大豆、小麦等农作物的氨基酸含量进行检测登录“爱仪器仪表网”,坐享一站式购物体验。

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蓝孔雀、眼镜蛇、滑鼠蛇、海蛇、海龙和海星为我国近年来新兴的农业特种养殖动物,国家政策鼓励和支持特种养殖动物的研究开发利用及产业发展,减少对野生资源的依赖,具有保护野生动物和生态意义。同时,上述6种动物是我国传统中医药药材及特色食材。我国明朝李时珍《本草纲目》收载孔雀,曰其辟恶,解大毒、中毒、药毒。服食孔雀后,服药必不效,为其解毒也[1-3]。西汉《神农木草经》和唐代《本草拾遗》记载蛇,均曰其祛风燥湿、通络活血,用于治疗风湿痹痛、四肢麻术等。我国民间自古有南人嗜蛇的说法。滑鼠蛇蛇肉中所含的亮氨酸、赖氨酸、丙氨酸及缬氨酸为人体必需氨基酸,所含的谷氨酸使蛇肉清香味美,还能够增强脑细胞活力,帮助记忆[4-5]。眼镜蛇肉质细腻、滋味鲜美、祛风除湿、舒筋活络,主治风湿性关节炎、无名疼痛等,是深受人们喜爱的可用于强身壮体的美味佳肴[6-7]。海蛇,味辛、咸、性平,归肝、肾经,祛风止痛、通络活血、滋补强壮等,用于治疗风湿痹病、四肢麻木、关节疼痛及疥癣恶疮等[8]。海龙可降低唿吸中枢兴奋性,使唿吸运动趋于安静而呈现镇咳和平喘作用,海龙可强精益气,主治四肢发冷、水肿的肾阳虚证[澳门新蒲京娱乐诚,9-11]。海星可抗菌、降血压、降血糖、抗疲劳、抗炎、促骨细胞生长、抗骨质疏松及调节生殖发育等[12]。牛磺酸可以调节机体糖类和脂类代谢、加强心脏功能、增强体质、消除疲劳和提高机体免疫力,尤其是可以改善学习记忆能力。随着现代科技和医学发展,人们日益认识到这6种资源较高的营养、保健及医药价值,因其利于健康和防治疾病,市场需求不断上升,推动了产业发展。

目前,检测氨基酸的方法主要有高效液相色谱[13-15]、HPLC-串联质谱[16-18]和全自动氨基酸分析仪测定法[19-21]。全自动氨基酸分析仪的优点[22]在于采用在线衍生和氮气全封闭系统,可获得较高灵敏度、较低检出限和较好重现性。之前未见报道用全自动氨基酸分析仪测定蓝孔雀、眼镜蛇和滑鼠蛇肉中牛磺酸的含量,本研究运用全自动氨基酸分析仪法测定上述6种动物肉中包括牛磺酸在内的18种氨基酸的含量。

1材料与方法

1.1材料与试剂

人工养殖蓝孔雀肉干粉广西龙凤谷农业种植养殖场;人工养殖眼镜蛇的活蛇样品和滑鼠蛇的活蛇样品及肉干粉样品广西灵山龙璇蛇业有限公司;海蛇、海龙、海星钦州市嘉园农商开发有限公司;将眼镜蛇、滑鼠蛇活蛇样品安乐死,洗净并吸干表面水分,去皮及内脏,拆去蛇骨,剩余为实验用的纯蛇肉,以上样品均为6个批次。

氨基酸混合标准溶液德国Sigma-Aldrich公司;牛磺酸标准物质上海安谱实验科技股份有限公司。

盐酸、乙酸锌、亚铁氰化钾国药集团化学试剂有限公司;0.04
mol/L柠檬酸钠缓冲液、0.5
mol/L氢氧化钠再生溶液、样品稀释液、茚三酮德国Sykam公司;高纯氮气广西瑞达化工技术有限公司;超纯水实验室自制。

1.2仪器与设备

S433D全自动氨基酸分析仪德国Sykam公司;XS205DU电子天平瑞士Mettler
Toledo公司;G560E快速混匀器美国Scientific Industries有限公司;N-EVAP
112氮吹仪美国Organomation
Associates公司;Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司;韩国大韩WEB-6水浴锅苏州安创仪器有限公司;S120H超声波发生器德国Elma公司。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱:磺酸型阳离子交换树脂;分离柱:不锈钢柱,填充交换树脂,型号:No.855-3506;柱温57℃;流动相流速0.40
mL/min;反应柱:不锈钢柱,填充石英砂,型号:No.855-3523;反应器温度135℃;茚三酮流速0.35
mL/min;进样量50μL;检测波长:脯氨酸在440
nm波长处测定,其余16种氨基酸和牛磺酸在570
nm波长处测定;流动相梯度洗脱程序如表1所示。

1.3.2样品前处理

眼镜蛇鲜肉和滑鼠蛇鲜肉分别取2.0 g,加入90%乙醇沉淀蛋白后,加10 mL 6
mol/L HCl溶液均质粉碎均匀后转移至水解管中,补足10 mL 6 mol/L
HCl溶液;充入氮气将水解管中的氧气赶净后立即密封,置烘箱中110℃水解22
h后取出;放置至室温,测得其pH值约为4.9;转移至离心管中,10 000 r/min离心5
min,取上清液5.0 mL水浴蒸干,用样品稀释液复溶至5.0 mL。

蓝孔雀肉干粉、滑鼠蛇肉干粉、海蛇肉干粉、海龙肉干粉和海星肉干粉分别称取2.0
g,加入90%乙醇沉淀蛋白后,加10 mL 6 mol/L
HCl溶液,置于水解管中,充入氮气将水解管中的氧气赶净后立即密封,置烘箱中110℃水解22
h后取出;放置至室温,测得其pH值约为6.6;用6 mol/L
HCl溶液调节pH值至5.0±0.2后转移至离心管中,10 000 r/min离心5
min,取上清液5.0 mL水浴蒸干,用样品稀释液复溶至5.0 mL。

1.3.3标准溶液的配制

精密称取牛磺酸标准品100.0 mg,置于10
mL容量瓶中,用超纯水定容,摇匀,配制成质量浓度为10
mg/mL的标准储备溶液。取牛磺酸标准储备溶液1 mL置于50
mL容量瓶中,用样品稀释液定容,摇匀,配制成质量浓度为200μg/mL的标准工作溶液,置于4℃冰箱中1个月,备用。

分别精密量取牛磺酸标准工作溶液和氨基酸混合标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
mL,分别加入到10
mL容量瓶中,用样品稀释液稀释成不同质量浓度的系列混合标准溶液。

1.3.4氨基酸含量测定

对蓝孔雀等6种动物肉各6个批次进行游离氨基酸含量测定及分析,按照公式~计算。

1.3.5回收率实验

取蓝孔雀肉干粉样品,将其作为空白基质,加入低质量浓度混合标准溶液和高质量浓度混合标准工作溶液,按照1.3.2节的方法处理样品,分别进行3次平行实验,测定相应的峰面积,计算平均回收率和相对标准偏差。

1.3.6精密度实验

精密吸取同一批蓝孔雀样品溶液,按照1.3.1节中的色谱条件,进样50μL,平行测定5次。分别测定18种氨基酸的含量,计算RSD,考察方法的精密度。

1.3.7稳定性实验

精密吸取同一批蓝孔雀样品溶液,在0、2、4、6、8
h各进样50μL,分别测定18种氨基酸的含量,计算RSD,考察方法的稳定性。

1.3.8重复性实验

均匀称取蓝孔雀样品6份,每份1.00
g,按照1.3.2节的方法处理样品,分别测定18种氨基酸的含量,计算RSD,考察方法的重复性。

2结果与分析

2.1样品前处理条件的优化

眼镜蛇鲜肉和滑鼠蛇鲜肉均为鲜肉样品,计算结果按干基折算。经过反复实验,鲜肉样品的pH值为6.1,肉干粉样品性状已经为干基,肉干粉的pH值为6.8,根据氨基酸分析仪特性和氨基酸结构特点,最后上机样品需为酸性,pH值3.5~4.5,此时对氨基酸的分离效果比较好。

2种基质基线无差别,均较毛躁

由表2可知,鲜肉和肉干粉水解后的状态不同,酸碱性不同,氨基酸水解出来的程度也会不同,因此样品经过水解后的水解液需要测定pH值。同时,无论鲜肉还是肉干粉,样品本身均含蛋白质、脂肪等大分子物质,若上机前不进行去除,杂质会干扰目标峰,影响积分,造成定量不准确。因此,本研究采用2种不同的样品前处理方法进行考察。

方法1:目前,去除蛋白质的常用溶剂为乙酸锌和亚铁氰化钾溶液[23-25],本研究考察这2种沉淀剂对鲜肉样品和肉干粉样品中蛋白质的沉淀效果[26-28]。称取样品1.0
g,分别加入上述2种沉淀剂。由表2可知,乙酸锌和亚铁氰化钾溶液能够很好地去除蛋白质。去除蛋白质等杂质后的样品加入10
mL 6 mol/L HCl溶液进行水解[29-31]。

方法2:常规氨基酸分析仪用90%乙醇溶液对鲜肉样品和肉干粉样品中的蛋白质等大分子物质进行沉淀去除,结果如表2所示。去除蛋白质后的样品经过氮吹干,加入10
mL 6 mol/L HCl溶液,置于水解管中进行水解。

方法1中的乙酸锌和亚铁氰化钾溶液虽然蛋白质沉淀效果较好,但是经过上机发现,各氨基酸的基线不稳,比较毛躁,且目标峰响应值不高,仍有部分杂质峰干扰,原因可能是乙酸锌和亚铁氰化钾影响色谱柱对目标峰的分离。本研究所用色谱柱为阳离子交换柱,上述2种沉淀剂均含有阳离子,会使得色谱柱柱效降低,进而导致游离氨基酸总量检测不准确。方法2中大部分蛋白质在90%乙醇中变性,再经过酸水解后也能去除一部分蛋白质,使氨基酸肽链断开,各氨基酸基线平稳,目标峰响应值较高,峰形较好,杂质干扰少。综上所述,本研究采用方法2进行样品前处理。

2.2方法的线性关系及检出限

2.3方法回收率、精密度、稳定性及重复性