PCR仪百科简介

发布时间:17-05-03 14:49分类:技术文章 标签:PCR仪,PCR仪百科简介
摘要:简单的说,PCR*是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内InVitro的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。PCR简介PCR的要素基本的PCR须具备1.要被复制的DNA模板
Template2.界定复制范围两端的引物Primers.3.DNA聚合酶Taq.
Polymearse4.合成的原料(四种脱氧核苷酸)及水。PCR仪工作原理利用升温使DNA变性,用限制性内切酶使DNA双链解链,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的PCR的反应包括三个主要步骤分别是1.
Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所谓
Denaturing乃是将DNA加热(至90~95℃)变性,
将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令
Primers于一定的温度下(冷却至55~60℃)附着于模板DNA两端。
*后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加热至70~75℃)进行引物的延长
Extension of
primers及另一股的合成。PCR的*早设想核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年*早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis
等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制PCR的改进与完善Mullis*初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌
DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,
90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初,Keohanog改用T4
DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki
等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus
中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别,将此酶命名为TaqDNA多聚酶Taq
DNAPolymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。PCR仪的分类普通的PCR仪把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,叫传统的PCR仪,也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的,对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科研研究,教学,医学临床,检验检疫等机构。梯度PCR仪把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常有12种温度梯度,这样的仪器*叫梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段,其*适退火温度事不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增,*可以筛选出表达量高的*适退火温度,进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间。主要用于科研,教学机构。梯度PCR仪,在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。原位PCR仪用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪,如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增,不但可以检测到靶DNA,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。实时荧光定量PCR仪在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,*成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同,只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)。荧光定量PCR仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测,生物医药研发,食品行业,科研院校等机构。获得诺贝尔奖的PCR技术1995年,美国科学家Mulis众望所归地获得了诺贝尔化学奖,他所取得的成*是发明了PCR技术。PCR,中文译为聚合酶链式反应,其实是一种DNA的快速扩增技术,其扩增效率之高*象核裂变的“链式反应”那样。PCR技术通过两个短的称为引物的
DNA小片段和一种耐热的酶的作用,可以在3个小时内把特定的DNA量提高1000万倍。这种技术一问世,立刻引起了分子生物学研究的一场革命,人们利用
这种轰动全的技术很快*把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步。可以这么说,PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破,而且随着PCR技术的
日趋完善,PCR在人类社会生活中的应用也越来越广泛。比如说在“DNA指纹”
中我们提到,科学家们只需要一根头发甚至一个细胞*可以完成DNA指纹的鉴定工作,这里实际上*要采用PCR技术,因为一个细胞中的DNA含量实在太少
了,人们根本不可能检测到它的指纹;有了PCR技术*好办了,通过PCR技术把这个细胞中的DNA片断扩增1000万倍,这样DNA量*足够作指纹鉴定了。
再比如,在医院里检验血液中的某种病毒,有时病毒量极少(例如有的艾滋病病毒携带者),通过传统的检查方法费力又费时,这时PCR技术也许*可以帮上忙。
可以*选定这种病毒DNA上的一段DNA,设计合适的引物DNA,然后通过PCR技术一扩增很快*可以判断出血样中是否扩增出了大量的DNA,如果是的
话,那么*说明血样中带有该种病毒了。PCR方法不但有极高的灵敏度,而且可以同时一次做近百个扩增反应,省时省力效率高。PCR技术神奇*神奇在以下几个特点上:一是被扩增的DNA所需量极小,理论上讲一个分子*可以用于扩增了;二是扩
增效率高,目的基因的量成指数形式扩增,几个小时*扩增1000万倍以上。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监
测等诸多方面,真不愧是“获得诺贝尔奖”的好技术!北京熙缜隆博环保科技有限公司是经销进口仪器设备的供应商,我们的产品优惠,质量保证,原装进口,欢迎前来选购!

核心提示: 聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、 快速

聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、 快速、
简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

PCR的最早设想
核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis
等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件—摸板DNA
,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I
的Klenow片段,其缺点是:①Klenow酶不耐高温,
90℃会变性失活,每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初,Keohanog改用T4
DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 中提取到一种耐热DNA聚合酶。
此酶具有以下特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I
Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术的基本原理

PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA
链互补的半保留复制链重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,
2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝

PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA
扩增量可用Y=n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA
片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期, 即出现“停滞效应”
,这种效应称平台期数、PCR
扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,
以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸, 其5’端是固定的,3′
端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链结合。引物在与新链结合时,
由于新链模板的5’端序列是固定的,
这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,
保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,
而“长产物片段”则以算术倍数增加, 几乎可以忽略不计,
这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系

10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10~100pmol 模板DNA
0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至
100ul PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR
产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,
就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:
以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,
这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应,
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M
NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,
-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等,如其中任何一种浓度不同于其它几种时,就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

澳门蒲京赌场手机版,模板核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS
还能与蛋白质结合而沉淀;
蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq
DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。